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    高溫快速消化與國標消化的凱氏定氮法測定蛋白質含量的比較研究

    [導讀]比較高溫消化與國標消化的凱氏定氮法檢測蛋白含量的準確性與穩定性有無差異,以達到簡化操作、節省時間的目的

    凱氏定氮法,是一種經典的測定蛋白質含量的 方法。其國標規定的基本檢測過程包括: 消化: 樣 品和消化劑、硫酸一同加熱,使蛋白質消化分解并 釋放出氨,氨與硫酸結合生成硫酸銨; 蒸餾: 堿化蒸 餾使硫酸銨中的氨游離; 滴定: 用硼酸溶液吸收后 再以硫酸或鹽酸標準溶液滴定; 計算: 根據酸的消耗量乘以換算系數,即得出樣品中蛋白質含量。整 個過程至少需要 6 h 的時間,其中消化這一過程即 至少需要 3~ 4 h ,耗時較長且操作繁瑣。為此,我 們經過長時間的實踐操作總結,對凱氏定氮法中消 化這一過程進行了改進,以期達到簡化操作,縮短 時間的目的。

    1 方法

    1. 1 實驗分組 分為 2 組: 對照組和實驗組。兩組在測定樣本 蛋白質含量的過程中,采用不同的消化方法,之后 的蒸餾、滴定、計算方法,則完全相同。

    1. 1. 1 對照組: 操作嚴格按照國標規定〔1〕進行。其 采用的消化方法為小火碳化消化法: 取樣品稀釋液 1. 0mL 與消化劑及硫酸一起加入定氮瓶內,于瓶口 放一漏斗,將瓶以 45° 角斜支于有小孔的石棉網上加 熱消化,消化過程要求小火( 400℃) 碳化3 h 左右。

    1. 1. 2 實驗組: 采用的消化方法是高溫消化法: 將樣 品稀釋液 1. 0 mL 與消化劑一起加入定氮瓶內保持 1 000℃的高溫持續加熱,其過程要求保持定氮瓶內 液體沸騰,但所產生的蛋白質氣泡不溢出瓶口,同時 產生的蒸餾水氣體在瓶壁遇冷回流,可以將瓶內壁上 的蛋白質帶回瓶底進行消化,整個消化過程大約 1h 。

    1. 2 蛋白質含量檢測

    1. 2. 1 兩組方法的穩定性、準確性比較: 分別對 50 g/L蛋白校準液(上海申索)及 15 份人血白蛋白 樣品(蛋白含量未知)進行兩種方法的蛋白質含量 檢測,前者重復 15 次。

    1. 2. 2 實驗組蛋白回收率檢測(見表 1): 任取 2 種 含蛋白的樣品A 、B(蛋白含量未知) ,每種樣品分別 取3 份各 9. 6 mL,加入 50 g/L 的蛋白標準液 0 μ L、 100 μ L、400 μ L 和分別對應 400 μ L、300 μ L、0 μ L 的生 理鹽水,執行4 次重復試驗,進行2 種方法的蛋白質 含量檢測。最后計算回收率。

    1. 3 統計學分析 數據以 x ±SD 表示,兩組間結果比較采用配對 資料的 t 檢驗及回歸分析。

    2 結果

    2. 1 兩組方法的穩定性、準確性比較(見圖 1) 對50 g/L 蛋白校準液進行蛋白質含量檢測結 果,國標消化法為 49. 95 g/L±0. 00 g/L,高溫消化 法為 49. 91 g/L±0. 00 g/L,兩種方法無顯著差異(t =1. 1602, P >0. 05)。蛋白校準液氮含量檢測結 果: 國標消化法為8. 20 g/L±0. 00 g/L,高溫消化為 8. 21 g/L ±0. 00 g/L,2 種方法無顯著差異( t =
    1. 000, P >0. 05)。 對人血白蛋白樣品進行蛋白質含量檢測結果, 國標消化法為 97. 61 g/L±0. 57 g/L,高溫消化法為 97. 65g/L ±0. 55 g/L,兩種方法無顯著差異( t = 0. 5762, P >0. 05)。樣品氮含量結果: 國標消化法為 15. 6 g/L±0. 01 g/L,高溫消化為 15. 6 g/L±0. 01g/L, 兩種方法無顯著差異( t =0. 8069, P >0. 05)。 將兩種方法對蛋白標液和樣品檢測結果進行 回歸分析(見圖 2) ,得出Y =0. 9987 X +0. 0797 , R2 =0. 9999。
    2. 2 實驗組蛋白回收率檢測 結果見表 1。相對 標準偏 差分別 為 1. 7%、 0. 8%、1. 7%和 1. 2%,兩種分別加入 0 μ L、100 μ L、 400 μ L、50 g/L 的蛋白標準液的混合樣品回收率分別 為: 98. 0%、97. 5%、98. 0%和98. 5%,平均為 98. 0%3 討論 近年來,對樣品中蛋白質含量檢測的準確度要 求越來越高,特別是奶粉的“三聚氰胺”事件發生以 來,在對有關含氮的各檢測方法中凱氏定氮法的標 準地位也再一次被確定。凱氏定氮法不僅是對含 氮的有機化合物定量的標準方法,也是蛋白質含量 測定最經典的方法,但其同時也存在操作步驟多, 耗費時間長等缺點。國標規定的凱氏定氮法測定 蛋白質含量時,其消化過程要求小火碳化,溫度約 400℃,待 樣品 呈澄 清透 明后 再繼 續大 火 消化 30 min ,總消化過程需要 3~ 4 h ,整個蛋白檢測過程 至少需要 6 h 的時間。

    為了縮短檢測時間,本實驗室采用高溫持續消 化的方法代替國標的小火碳化消化法,使加熱溫度 保持在1 000℃左右,使消化液處于持續沸騰狀態, 同時產生的蛋白質泡沫又不溢出瓶口。高溫消化 法使消化過程縮短為 1 h 左右,使整個蛋白檢測過 程縮短為 3~ 4 h。 通過高溫和小火碳化兩種消化方法對樣本蛋白含量進行檢測并比較,結果顯示: 兩種測定方法 在穩定性、準確性方面無顯著差異。兩種方法比較 的回歸分析顯示斜率為 0. 9987,接近于 1. 00,顯示 出的比例分析誤差是 0. 13%,這種誤差相當于在 50 g/L為-0. 065 g/L,在 100 g/L 為-0. 065 g/L。Y 軸截矩接近于 0,表明固有系統誤差很小,符合實驗 要求;厥章蕼y定 x =98. 0%,即相當于 2%的比 例誤差。這一誤差小于實驗允許的總誤差,再次驗 證了該方法具有良好的準確性。 但本實驗室經多次試驗與統計學分析發現,高 溫消化方法并不適用于免疫球蛋白含量較高的樣 品的蛋白含量檢測,其原因有待于進一步探索。

    綜上所述,本研究揭示高溫消化方法檢測蛋白 含量結果準確、快速,較國標規定的方法大大縮短 了工作時間,提高了工作的效率,適于廣泛推廣。

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