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    凱氏定氮法測定人血白蛋白中蛋白質含量的不確定度評價

    [導讀]: 測定總氮時樣品的稀釋和量取以及實際消 耗硫酸滴定液體積、測量重復性 、硫酸滴定液的濃度標定和稀釋是凱氏定氮法測定人血白蛋白含量不確定度的主 要因素,通過分析上述不確定度分量對試驗進行優化,可使測定結果更加可靠。

     蛋白質含量是人血白蛋白質量評價的重要指 標。不確定度是與測量結果相關聯的參數,表征合 理地賦予被測量值的分散性。本文對凱氏定氮法測 定人血白蛋白中蛋白質含量的不確定度來源和大小 進行分析和評價,并初步探討在運用該方法的過程 中應注意的問題,旨在為人血白蛋白以及食品( 尤 其是乳制品) 中的蛋白質含量測定提供一定參考。  實驗材料及條件

    1. 1 儀器及試藥 儀器: 自動定氮儀(Ge r h a r d tVa p o de s t 30 Di g e s t S y s t e m); 玻璃儀器( 1、2、10 mL移液管; 20、100 mL 容量瓶; 25 mL酸式滴定管) , 20 ℃下校準。
    試藥: 人血白蛋白( 貴陽黔峰生物制品有限公 司生產,批號為 20070830,規格為 20%, 10 g); 0. 005 mo l ·L -1硫酸滴定液 ( 本所化學室標定 ); 10%鎢酸鈉溶液; 0. 33 mo l ·L -1 硫酸溶液; 2%硼酸 溶液; 40%氫氧化鈉溶液; 甲基紅溴甲酚綠混合指 示液; 98%硫酸; 無水硫酸鈉; 硫酸銅。

    1. 2 實驗室環境 溫度變化范圍: ( 20±4)℃。  

    方法

    2. 1 試驗過程 按照中國藥典 2005年版三部[ 1 ] 的規定,測定人 血白蛋白中的蛋白質含量,過程見圖 1。2. 2 建立數學模型 人血白蛋白中蛋白質含量 W的計算公式為:
    W(%)=C PN×6. 25×1/10×1/20×r e p×100% 其中, C P N=C TN– C NPN

    C T N=(V T 4– V 0) ×(V T 1 / V T 2) ×0. 140 1 ×C D/0. 005 × (V D 1 /V D 2)/V T 3 C NPN=(V N4– V 0)×(V N1/ V N 2)×0. 140 1 ×C D/0. 005 × (V D1/ V D2) / V N 3 r e p為總重復性因子。 以 y 表示 W , x i 表示第 i 個影響參數,得 y的合 成標準不確定度為: u c(y )= ∑ n i =1c 2 iu 2(x i )= ∑∑ n i=1u 2(y , x i ) 其中 c i 為靈敏系數,記為偏導 y / x ;u (y , x i) 為由 x i 不確 定度引起的 y的不確定度。  不確定度的來源及分析

    3. 1 不確定度的來源 從人血白蛋白中蛋白質含量測定流程圖來看,凱 氏定氮法測定蛋白含量的不確定度主要來源于 9個 方面: 1) 試驗重復性; 2) 標定硫酸滴定液濃度; 3) 稀釋 硫酸滴定液; 4) 測定總氮稀釋樣品; 5) 滴定總氮吸取 樣品; 6) 滴定總氮實際消耗硫酸滴定液的體積; 7) 測 定非蛋白氮稀釋樣品; 8) 滴定非蛋白氮吸取樣品; 9) 滴定非蛋白氮實際消耗硫酸滴定液的體積。

    3. 2 不確定度 u (x i) 的量化分析

    3. 2. 1 由試驗重復性引入的標準不確定度 u (r e p ) 按藥典標準對人血白蛋白樣品平行測定 6次,結 果見表 1。 定規程》查得, A級 10. 0 mL移液管和 A級 100 mL 容量瓶的允許偏差分別為 ±0. 02和 ±0. 10 mL [2] , 近似于三角形分布 [ 3] , 換算成校準不確定度分別 為: 0. 02/60. 5 =0. 008 2 mL , 0. 10/60. 5 =0. 041 mL 。 該容量瓶和移液管均在 20 ℃校準。本實驗室溫 度變化范圍為( 20 ± 4)℃,近似于矩形分布。水的膨 脹系數為 2. 1 × 10 4。換算成溫度不確定度分別為: ( 10. 0×2. 1×10-4 ×4)/30.5 =0. 0048 mL ( 100×2. 1×10-4 ×4) /30. 5 =0. 048 mL 由上述不確定度分量合成得: u(V D1)=( 0. 008 22 +0. 004 82) 0. 5 =0. 009 5 mL u(V D2)=( 0. 0412 +0. 048 2) 0. 5 =0. 064 mL u(V D1/ V D 2)= [( 0. 009 5/10. 0) 2 +( 0. 064/100) 2] 0. 5 ×0. 1 =0. 000 11

    3. 2. 4 測定總氮稀釋樣品(V T 1 /V T 2) 引入的不確定 度 u(V T 1/ V T 2) 由《常用玻璃量器檢定規程》可知, A級 1. 0 mL 移液管和 A級 20 mL容量瓶的允許偏差分別為 ±0. 007和 ±0. 02 mL [ 2] ,近似于三角形分布[ 3] ,換 算成校準不確定度分別為: 0. 007/60. 5 =0. 0029 mL 0. 02/60. 5 =0. 008 2 mL 換算成溫度不確定度分別為: 1. 0×2. 1×10-4 ×4/3 0. 5 =0. 000 48 mL 20×2. 1×10-4 ×4/30. 5 =0. 0097 mL 由上述不確定度分量合成得: u(V T 1)=( 0. 00292 +0. 00048 2) 0. 5 =0. 002 9mL u(V T 2)=( 0. 00822 +0. 00972) 0. 5 =0. 0127 mL u(V T 1 /V T 2)= [( 0. 002 9/1. 0) 2 +( 0. 012 7/20) 2] 0.5 ×0. 05 =0. 000 15

    3. 2. 5 滴定總氮吸取樣品( V T 3) 引入的不確定度 u ( V T 3) 與“3. 2. 4”項相同, A級 1. 0 mL移液管的的校準 不確定度為 0. 0029 mL ,溫度不確定度為0. 00048 mL 。 由上述不確定度分量合成得: u(V T 3)=( 0. 00292 +0. 00048 2) 0. 5 =0. 002 9mL

    3. 2. 6 滴定總氮實際消耗硫酸滴定液的體積 (V T 4 -V 0) 引入的不確定度 u(V T 4 -V 0) 1) 肉眼判斷終點所引入的不確定度已包含在 測量重復性引入的標準不確定度 u (r e p ) 中,此處不 再考慮; 2) 滴定管引入的標準不確定度: 由《常用玻 璃量器檢定規程》可知, 25. 0 mL的 A級滴定管其最 大容量的允許偏差為 ±0. 04 mL [2] ,近似于三角形 分布[ 3] ,換算成校準不確度為:0. 04/60. 5 =0. 0164 mL V T 4 =12. 36 mL V 0 =0. 35 mL 溫度不確定度分別為: 12. 36×2. 1×10-4 ×4/30. 5 =0. 006 0 mL 0. 35×2. 1×10 -4 ×4/30. 5 =0. 000 2mL 上述標準不確定度分量合成得: u (V T 4)=( 0. 016 42 +0. 006 02) 0.5 =0. 0175 mL u (V 0)=( 0. 016 42 +0. 000 22) 0. 5 =0. 016 4 mL u (V T 4 -V 0)=( 0. 017 52 +0. 01642) 0.5 =0. 0240 mL

    3. 2. 7 測定非蛋白氮稀釋樣品(V N 1 / V N 2 ) 引入的 不確定度 u(V N 1 / V N 2) 由《常用玻璃量器檢定規程》可知, A級 2. 0 mL 移液管和 A級 20 mL容量瓶的允許偏差分別為 ±0. 010和 ±0. 02 mL [ 2 ] ,近似于三角形分布[3] ,換 算成校準不確定度分別為: 0. 010/60. 5 =0. 004 1 mL 0. 02/60. 5 =0. 0082 mL 溫度不確定度分別為: 2. 0×2. 1×10-4 ×4/30. 5 =0. 00097mL 20×2. 1×10-4 ×4/30. 5 =0. 009 7 mL 由上述不確定度分量合成得: u (V N 1)=( 0. 00412 +0. 000972) 0.5 =0. 0042 mL; u (V N 2)=( 0. 00822 +0. 00972) 0. 5 =0. 0127 mL; u (V N 1 /V N2)= [ ( 0. 0042/2. 0) 2 +( 0. 0127/20) 2] 0. 5 ×0. 1= 0. 000 22

    3. 2. 8 滴定非蛋白氮吸取樣品(V N 3) 引入的不確定 度 u (V N 3) u (V N3) 即由 5. 0 mL移液管引入的不確定度。 由《常用玻璃量器檢定規程》可知, A級 5. 0 mL移 液管的允許偏差為 ±0. 015 mL [ 2] ,近似于三角形分 布[ 3] ,換算成校準不確定度為: 0. 015/60. 5 =0. 006 2 mL溫度不確定度為:
    5. 0×2. 1×10-4 ×4/3 0. 5 =0. 002 4mL 由上述不確定度分量合成得: u(V N3)=( 0. 006 22 +0. 002 42) 0. 5 =0. 006 6 mL

    3. 2. 9 滴定非蛋白氮實際消耗硫酸滴定液的體積 (V N 4 -V 0) 引入的不確定度 u (V N 4 -V 0) 1) 肉眼判斷終點所引入的不確定度已被包含 在測量重復性引入的標準不確定度 u(r e p) 中,在此 處不再考慮。2) 滴定管引入的標準不確定度: 查標 準得 25. 0 mL的 A級滴定管其最大容量的允許偏 差為 ±0. 04 mL [ 2 ] ,近似于三角形分布[ 3 ] ,換算成校 準不確度為: 0. 04/60. 5 =0. 016 4 mL V N 4 =6. 15 mL V 0 =0. 35mL 溫度不確定度分別為: 6. 15×2. 1×10-4 ×4/30. 5 =0. 003 0 mL 0. 35×2. 1×10-4 ×4/30. 5 =0. 000 2 mL 上述標準不確定度分量合成得: u(V N4)=( 0. 016 42 +0. 003 02) 0. 5 =0. 016 7 mL u(V 0)=( 0. 01642 +0. 00022) 0. 5 =0. 0164 mL u(V N 4 -V 0)=( 0. 016 72 +0. 01642) 0. 5 =0. 023 4mL

    3. 3 不確定分量及各分量分析 在不確定度表達式中,假如 y(x 1, x 2, …, x i) 對 x i 是線性或與 x i 相比其 u (x i) 較小,偏導( y / x ) 可 近似為: y / x ≈{y [ x i+u(x i) ] -y(x i )} /u (x i ) 將 u (x i) 計入,獲得因 x i 不確定度引起的 y的不 確定度 u(y , x i) [ 4] ,即: u(y , x i)≈y {x 1, x 2…[x i+u (x i ) ]…x n}-y (x 1, x 2, …, x i , …, x n) 根據上式,由各不確定分量 u( x i) 進行計算可得到 對應的 u ( y , x i) ,結果見表 2。

    3. 4 合成標準不確定度及擴展不確定度的計算 根據表 2結果,可得合成標準不確定度(u c) 為: u c= ∑ n i=1 u 2(y , x i )=0. 62% 擴展不確定度(U) 的計算公式為: U=k ·u c 置信因子(k ) 取 2,即置信概率為 95%,可得: U=0. 62% ×2=1. 2% 故人血白蛋白中蛋白質含量 W(%) 可表示為 ( 104. 7±1. 2)%。  

    討論
    根據小分量不確定度不足最大分量不確定度的 1/3時,小分量不確定度可以忽略不計的原則[ 4] ,由 以上的評定結果可看出,本方法測定結果的不確度 主要來源于 6個分量: 測定總氮稀釋樣品的不確定 度 u(V T 1/ V T 2 ) 、滴定總氮吸取樣品的不確定度 u (V T 3) 、測量重復性 u(r e p) 、標定硫酸滴定液濃度 的不確定度 u (C D) 、滴定總氮實際消耗硫酸滴定液 的不確定度 u (V T 4 -V 0) 、稀釋硫酸滴定液的不確定 度 u (V D 1 /V D 2) 。 在試驗中使用的玻璃儀器均為 A級,因此不能 通過提高儀器的精密度改善結果, 但可采取下述2個措施降低本方法的不確定度。 1) 使用較大規格的移液管。 u(V T 1 / V T 2 ) 與 u(V T 3)較大的原因是 1. 0 mL移液管引入的不確定 度明顯大于較大規格的移液管。故在使用本方法測 定樣品時,在樣品量允許的前提下,通過重新設計試 驗步驟,在吸取樣品時選用較大規格的移液管,將能 顯著降低 u (V T 1 /V T 2) 與 u (V T 3) 。 2) 使用合適的自動化儀器進行樣品消化及滴定, 同時規范試驗操作,嚴格控制試驗條件,將能有效控 制試驗過程中產生的隨機誤差,從而降低 u (r e p ) 。

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